信帆生物帶您走進免疫熒光技術

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_免疫熒光

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

技術特點：

該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完*，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。

熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生物試劑的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生物試劑。

由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在研究檢驗中應用。

原理：

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反

直接法：

將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢

間接法：

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。

⑴熒光物質1）熒光色素許多物質都可產生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，大吸收光波長為490--495nm，大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用廣泛的熒光素。

其主要優(yōu)點是：

①人眼對黃綠色較為敏感，

②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。結構式如下：大吸收光波長為570nm，大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：大吸引光波長為550nm，大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

⑵其他熒光物質1）酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。

例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。

2）鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應用廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，適合用于分辨熒光免疫測定。

常見熒光：熒光素1)FITC2)RB2003)TRITC4）鑭系：Eu、Tb5)PE6）其它常見熒光素的特性

1)FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

2)RB200：橘紅色粉末，吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。

3)TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。

4）鑭系：Eu、Tb

5)PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。

6）其它：酶作用后產生熒光物質。酶作用生物質酶   底物   產物  激發(fā)光 發(fā)射光Β-G  MUG    MU     360    450AP   MUP    MU     360    450HRP  HPA   二聚體   317    414⑷合適熒光素的選擇

1）具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。

2）熒光效率高，標記后下降不明顯。

3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

4）標記后能保持生物學活性和免疫活性

5）標記方法簡單、快速。

6）安全無毒

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