豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒

（此說明書僅供參考，以包裝內英文說明書為準！！）

1、疾病概況

PEDV屬于冠狀病毒科，可以使任何年齡段的豬出現嚴重的小腸炎，初生仔豬容易死亡。這個病的癥狀與TGEV相似。

在歐洲和中國已受該病的傳播影響。1969年在歐洲爆發過此病毒的大流行。在1969年前，收集的豬血清中沒有出現相應的抗體。從那時開始，該病已向歐洲多個國家蔓延，嚴重的爆發則較少發生。在大型的養殖場里，病毒持續留在斷奶和失去母源抗體免疫力的仔豬體內。在這些場里，病毒可能與斷奶腹瀉有關。病毒的傳播主要通過豬的直接接觸傳染和接觸病毒污染物的間接傳染。

PED的研究癥狀包括厭食、嘔吐、腹瀉和脫水。在5日齡以下的感染豬由于發生嚴重的腹瀉和脫水，發病率和死亡率為100%；而大于10日齡的染病豬的發病率和死亡率為10%。

該病肉眼可見的病變是小腸邊緣的絨毛變短作為主要特征，與TGE的病變相似。結腸無病變。

2、試劑盒的介紹

從生物試劑母豬的初乳中檢測PED IgA抗體的試驗，對PED的防控有很大的意義。韓國安捷公司的PED IgA抗體ELISA試劑盒含有已經包被好PED IgA抗原的微孔酶標板。檢測時，包被抗原的酶標板與稀釋好的血清孵育，然后與羊抗豬的IgA-HRP酶標物反應。孵育后，在加入底物前用清洗液將沒有結合的物質清洗干凈。反應結合的酶跟孔中乳汁的PED IgA抗體的量成正比例。加入終止液結束反應，用酶標儀在456nm和620nm雙波長條件下，讀取結果。

3、試劑盒組成

1）抗原包被好的酶標板5塊

2）陰性對照：1ml1瓶

3）陽性對照：1ml1瓶

4）樣品稀釋液：80ml1瓶

5）20倍濃縮的清洗液：250ml1瓶

6）101倍濃縮的酶標物：1ml1瓶

7）酶標稀釋液：80ml1瓶

8）底物A：40ml1瓶

9）底物B：40ml1瓶

10）終止液：80ml1瓶

11）封板膜10塊

12）說明書1份

4、注意事項

為了得到重復性好的結果，建議必須遵循以下規定。

1）只用于體外診斷。

2）不同批號的試劑不能混合。

3）使用干凈的玻璃器皿，不準使用生銹的金屬容器。

4）接觸潛在感染物和實驗操作時，必須使用一次性手套。

5）使用底物和終止液時要小心，避免讓液體接觸皮膚、眼睛和粘膜。如果不慎沾上，應立即用自來水沖洗。

5、樣品收集和保存

1）從生物試劑的母豬身上采集乳汁樣本。

2）如果樣本不是馬上進行檢測的，請保存在2~8℃的環境中。要保存時間超過3天的，請將樣品保存在-20℃或更低的溫度環境中。使用前，請把樣品放到室溫環境進行回溫。

3）出現沉淀物的樣品會使結果不一致，該樣品不能進行實驗.

6、試劑的準備

1）使用前，將試劑盒的所有試劑回復到室溫。

2）不用稀釋陰、陽性對照液和樣品。

3）準備酶標物（101倍濃縮）：使用前，必須將酶標物按1:100進行稀釋。（10ul的酶標物加入1ml的酶標物稀釋液中進行稀釋。）

4）清洗液的準備（20倍濃縮）：使用前，必須將清洗液按1:19進行稀釋。如果洗液出現結晶物，請將洗液放在37℃處，加熱數分鐘即可溶解結晶物。（10ml清洗液加入190ml的純凈水中進行稀釋。）

5）底物的準備：使用前，將底物A和底物B按1:1混合。為了得到更好的檢測結果，在使用前，底物溶液要達到20~25℃，或培養30分鐘。

7、操作步驟

1）準備好用于樣品稀釋的酶標板。在每個微孔中加入100ul的樣品稀釋液。

2）陰、陽性對照液個2個孔，其余各孔為樣品孔。

加入10ul的陰性對照液于A1和B1孔

加入10ul的陽性對照液于C1和D1孔

其余各孔加入10ul樣品

3）用封板膜把反應孔蓋好，然后輕輕地振蕩酶標板。此步驟對實驗結果的重復性是很重要的。

4）在37℃下，孵育60分鐘。

5）用已稀釋好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要將板里的水扣干凈。

6）每孔加入100ul酶標物。

7）在37℃下，孵育30分鐘。

8）用已稀釋好的清洗液洗板5次，每次350ul。zui后一次洗板后，要將板里的水扣干凈。

9）每孔加入100ul底物。

10）18～25℃下，孵育15分鐘。

11）每孔加入100ul終止液終止反應。

12）用酶標儀，在450nm和620nm雙波長的條件下，讀取吸光值。必須在30分鐘內，完成讀取結果。讀取結果時，酶標板內不能出現氣泡。

8、檢測分析

1）檢測的有效性

①　陰性對照的平均OD值<0.200

②　陽性對照的平均OD值>0.500

③　如果上述其中一個值超出了規定的范圍，則該實驗被視為無效。所檢的樣品需要重新進行檢測。

2）計算判斷值

①　用A1和B1孔的吸光值來計算陰性對照的平均OD值。

判斷值＝（0.35＋陰性對照的平均OD值）

②　根據陰性對照的OD值，樣品結果的判斷標準如下：

-陽性結果：樣品OD值>判斷值

-陰性結果：樣品OD值<判斷值

③　舉例：

陰性對照平均OD值：0.078

判斷值＝0.35＋0.078＝0.428

樣品OD值為0.389：樣品為陰性

樣品OD值為0.894：樣品為陽性

9、局限性和干擾性

1）檢測步驟，注意事項和對結果的判定必須嚴格按照說明書進行。

2）采樣：

①　樣品中所含有的*，對測試結果沒有影響。

②　巴氏滅菌法（60℃條件下不少于10小時）消毒過的樣品可能導致活性減弱，故而不可用于檢測。

③　加熱滅活的樣品（56℃，30分鐘）并不影響試驗結果。

④　抗凝血劑如肝素，EDTA，檸檬酸鹽不會影響試驗結果。

⑤　溶血的樣品應在使用前離心，以免被細胞內成分干擾。

⑥　含有脂肪酶或黃疸的樣品并不影響檢測結果。

3）操作規程中樣品加入失敗，將會引起錯誤的結果，如有研究上有任何疑似PRRS病毒感染癥狀，建議重復檢驗。

10、保存條件

所有試劑都要保存在2～8℃的環境中。

11、穩定性

1）不要使用過期的試劑盒

2）準備的試劑的穩定性