一、實驗目的

   1、學習克隆工作中zui常用的雙酶切； 2、學習將外源基因與質(zhì)粒連接方法及操作技術(shù)； 3、學習氯化鈣法制備大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細胞的技術(shù)； 4、了解細胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中的意義。 5、外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。 6、學習鑒定重組子的方法。

二、 實驗原理

   重組子的建立：采用雙酶切質(zhì)粒載體pBR322和pUC18，酶切后產(chǎn)生了互補的粘性末端，在T4 DNA 連接酶的作用下，兩個質(zhì)粒片段連接。 感受態(tài)細胞(Competent cells)：受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competent cell) 。
    轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程(Genetic Engineering)等研究領域的基本實驗技術(shù)。

   電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。

   克隆的篩選：主要用不同抗生素(antibiotic)基因篩選。常用的抗生素(antibiotic)有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；

   重組質(zhì)粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質(zhì)粒克隆的方法常用的有α-互補、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。

   zui常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合α-互補現(xiàn)象來篩選。

三、試劑與器材

   1、試劑 pUC18質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa)，LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ，LB固體培養(yǎng)基，50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液，質(zhì)粒快速提取試劑盒（博大泰克），10 X Buffer K， Pst I，EcoR I (TaKaRa) 2、器材 電基因轉(zhuǎn)移議，恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀，超凈工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。

四、操作方法

   1．構(gòu)建重組質(zhì)粒 質(zhì)粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切，將酶切產(chǎn)物按照1：1的比例混合，使用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。 2．制備感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)細胞 收集大腸桿菌(Escherichia coli)細胞，采用CaCl2 處理，制備成感受態(tài)細胞。 3．重組子的轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒加入到制備的感受態(tài)細胞懸浮液中，電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。 4．重組子的篩選鑒定 采用藍白篩選重組子。酚快速抽提質(zhì)粒，酶切后電泳鑒定。

五、關鍵步驟與注意事項

   2．連接反應溫度選擇要適中，過高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定，過低會影響連接酶的活性。 3．連接反應兩種質(zhì)粒的比例為1：1，否則容易自連。 4．制備感受態(tài)細胞時要采用對數(shù)生長期初期的細胞，低溫處理時間要足夠。 5．電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適。 6．轉(zhuǎn)化及藍白篩選要作陰、陽性對照，防止出現(xiàn)假陽性、假陰性。