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明膠酶譜法試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟解析

更新時(shí)間：2017-06-21      瀏覽次數(shù)：1018
 　　明膠酶譜法試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟解析
　　明膠酶譜法，首先是將樣品進(jìn)行電泳分離，然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中，將樣品中的MMP-2和MMP-9復(fù)性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，zui后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
　　明膠酶譜法試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟：
　　1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞在的無血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。
　　2.次日收集上清液，將上清液移入離心管中2000rpm離心10min，-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/div>
　　3.根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞上清液中的蛋白濃度。與5×上樣緩沖液混合，16ul樣本+4ul上樣緩沖液。
　　4.配制分離膠和濃縮膠，20ul/孔上樣，4℃進(jìn)行SDS-PAGE電泳100v約1.5小時(shí)。
　　5.電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次,每次30分鐘,然后用漂洗液漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液中37℃孵育42h。
　　6.孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色3h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%,乙酸濃度分別為10%、10%、5%)分別脫色0.5、1、2h后，顯示出MMP-2（72KD）和MMP-9（92 KD）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析。
　　明膠酶譜法試劑盒注意事項(xiàng)：
　　1、明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
　　2、孵育液的PH在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的。
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