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更新時間：2017-07-26 
瀏覽次數：5704通過電泳區分不同的蛋白組分，并轉移至固相支持物（膜），通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測。可檢測到低至1～5ng（zui低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
Western Blot實驗步驟
1、 細胞總蛋白提取
1.1 對于懸浮細胞: 離心收集細胞，每106細胞加250 ul RIPA（在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。
1.2 對于貼壁細胞:
1.2.1 用TBS沖洗細胞2-3次。zui后一次*吸干殘留液。
1.2.2 加入適當體積的 RIPA（使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑）于培養板、瓶內3-5min。期間反復晃動培養板、瓶，使試劑與細胞充分接觸。
1.2.3 用細胞刮dao將細胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。
1.3 冰浴30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞*裂解。
1.4 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
2、 組織蛋白提取：
2.1 組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑）冰上*勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。
2.2 將勻漿液轉移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞*裂解。
2.3 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
3、 蛋白濃度測定：BCA法側蛋白濃度
4、 SDS-PAGE電泳
4.1 清洗玻璃板
4.2 灌膠與上樣
4.2.1 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。
4.2.2 按實驗安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
分離膠配比
分離膠濃度 | ||||||||||||
試劑 | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% |
H2O ml | 4.63 | 4 | 3.3 | 2.3 | 1.3 | 0.63 | 6.9 | 5.9 | 4.9 | 3.4 | 1.9 | 0.9 |
30％丙烯酰胺（29：1） ml | 2.67 | 3.3 | 4 | 5 | 6 | 6.67 | 4 | 5 | 6 | 7.5 | 9 | 10 |
1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 |
10％SDS ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
AP ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
TEMED ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul |
總體積 ml | 10ml | 15ml | ||||||||||
5%濃縮膠配比
試劑 | 濃度 5% | |||
H2O ml | 2 | 3 | 4 | 6 |
30％丙烯酰胺（29：1）ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
1M TRIS－Hcl(PH 6.8)ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
10％SDS ul | 40 | 60 | 80 | 120 |
AP ul | 30 | 45 | 60 | 90 |
TEMED ul | 4ul | 6ul | 8ul | 12ul |
總體積 ml | 3ml | 4.5ml | 6ml | 9ml |
4.2.3 按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
4.3 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75V，分離膠用120V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。
5 轉膜 （小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。）
5.1 準備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
5.2 在加有轉移液的盆里放入轉膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支玻棒，濾紙和經過活化的PVDF膜。
5.3 將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。
5.4 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。zui后蓋上另一個海綿墊。
5.5 轉膜條件（濕轉）
5.5.1 快轉。300mA恒流轉膜半小時，或者200mA轉膜1小時，時間可以略微調整，時間對應調整。
5.5.2 慢轉。轉膜過夜，25V恒壓轉膜過夜。
6 免疫反應
6.1 將轉好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)，封閉1h。
6.2 稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育過夜（快轉），或者4℃孵育抗體3小時（慢轉）。
6.3 用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min
6.4 將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min
7 化學發光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光。zui后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。根據不同的光強度調整曝光條件。
8 凝膠圖像分析 將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。
蛋白樣品制備的注意事項：
1、細胞數量達5×106
2、將細胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min。
Western blot實驗代測找上海信帆生物
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：
1、做膠：防止漏膠、進氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）
2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴散。
3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內外面不能聯通），將電壓調到90V開始電泳。
轉膜注意事項：
1、泡膜：轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移buffer浸泡20min。（1.凝膠若是沒在預冷的轉膜buffer中浸泡，就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮，導致出現轉移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）
2、轉膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板
3、轉膜條件：0.3 250V 1h40min 冰浴中進行轉膜（具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，反之則短）
4、避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。
5、夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不*。
6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉膜效率。
7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力，從而產生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體使用硝酸纖維素膜（NC膜）
關于磷酸化蛋白檢測的注意事項：
1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態！在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標本時刻保持在冰浴中！
2、使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉！（因為脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現很高的背景）。
抗體保存注意事項：
1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存！
2、對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃
2.1 分裝的量以一次實驗用完為好，zui少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。
2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來！
2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。
3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。
4、長期保存，加入疊氮鈉，防止細菌污染。
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