三羧甲基乙二胺-瓊脂糖

1 、產品介紹

NRPB58——Ni-TED NUPharose FF Ni-TED NUPharose FF是金屬離子脫落率最-低的一款金屬螯合親和填料，配基為三羧甲基乙二胺（tris-carboxymethyl ethylene diamine，TED）基團，配位金屬離子為Ni2+，

本產品的TED配基與Ni2+形成的五配位結構穩定性好，對螯合劑、還原劑、酸、堿等試劑有著出色的耐受性，可在10mM EDTA、100 mM β-ME或50 mM DTT等條件下正常使用，可在pH=1或pH=14的條件下處理24h后保持出色的色譜性能，也長期保存在10mM NaOH 中，洗脫液中需要的咪唑濃度相對其他金屬螯合填料更低。因此，Ni-TED NUPharose FF適合用于下列純化體系：

l 目標蛋白中含半胱-氨酸或者對氧敏感，需要添加 β-ME 或 DTT 時；

l 目標蛋白中含半胱-氨酸且有金屬反應性，需要添加 DTT 和 EDTA 時

l 目標蛋白容易被金屬蛋白酶水解，需要添加 EDTA 時；

l 目標蛋白對高濃度咪唑敏感，需要降低洗脫液中咪唑濃度時；

l 真核細胞表達體系中本身含 β-ME 或 EDTA 的情況；

l 對產物中金屬離子含量要求嚴格時。

Ni-TED NUPharoseFF的配基偶聯工藝經過了特殊的設計，使得成品的壓力/流速特性得到大幅提升，最大流速和耐壓分別超過1500cm/h和0.5MPa。通過配基修飾過程的優化，本產品在親和力（載量）和特異性（選擇性）之間取得良好的均衡：對帶組-氨酸標簽蛋白的結合量大于20 mg/mL的同時，一步純化后樣品純度可達90%以上。

2 、產品特點與技術指標 

a 三羧甲基乙二胺（TED）基團與基球之間有十個原子長度的間隔臂，為親和填料提 供更加高效的捕獲效果。

b90%體積以上的微球在此粒徑范圍。

c 10%穿透下的動態結合載量（DBC10%），測試的樣品為大腸桿菌表達帶組-氨酸標簽的重組蛋白，6 min 停留時間。

d  并非指只能在該流速范圍內工作。需結合柱高確定適宜的工作流速，通常情況下上樣的停留時間2~6 min 范圍內可保持出色的親和捕獲能力和純化效率。CIP 過程的流速則一般不超過 150 cm/h。

e 10 cm 柱高下的最大測試流速及該最大流速下的壓力。

3、金屬螯合親和層析

金屬離子親和層析是基于蛋白質分子表面的組-氨酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等形成配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為螯合離子來純化帶6個以上組-氨酸組成的標簽蛋白最為常見，本說明書也以該體系為例簡要闡述Ni-TED NUPharose FF的親和原理（圖1）。

NUPharose基球修飾上TED配基后，該配體擁有五個配位基團，其中兩個氮原子和三個氧原子與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數的八面體結構，剩余的一個自由配位點可以與溶劑分子或蛋白質分子結合。Ni2+與組-氨酸標簽蛋白的咪唑基團配位結合的過程即為金屬螯合填料與目標蛋白的特異性結合過程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭與Ni2+的結合。

金屬離子親和層析過程的非特異性吸附可能會來自離子相互作用、金屬離子與含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者可通過提高緩沖液的離子強度得到抑制，通常添加500mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過程中添加咪唑而除去。經過優化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。

Ni-TED NUPharose FF填料在使用過程中Ni2+掉落量極少，可連續使用多次。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體積。Ni-TED NUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達到壓縮比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分數為67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內（必要時使用裝柱器）， 為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統連接。

（7）壓柱：使柱內填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界面清晰穩定，標記界面穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與磷酸鹽、Tris-HCl等緩沖體系兼容，其中20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）的體系最為常用。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。緩沖液A的特點為不含或者含少量咪唑，pH在7~8之間居多，呈弱堿性。實際使用過程中，如果上樣料液的體積特別大，從降低成本的角度考慮，可不往料液中添加咪唑和NaCl來抑制非特異性吸附，而是在上樣后進行沖洗來去除雜質。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與緩沖液A對應為準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL填料"來設定，通常為DBC10%的50~80%，上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A 再平衡層析柱。

4.4  洗雜（Wash）

在緩沖液A中添加5~40mM的咪唑沖洗層析柱，可以將非特異性結合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會降低目標蛋白的收率。洗雜過程咪唑的濃度與不同蛋白的特性相關，可通過階躍洗雜過程（例如5mM、10mM、20 mM……）快速優化洗雜條件。洗雜的體積通常為3~10個柱體積。

4.5  洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩沖液A中加入咪唑），推薦在0~500mM范圍內進行階躍洗脫或者線性梯度洗脫，確定最-優的洗脫濃度。對于大多數帶組-氨酸標簽的蛋白，50~150 mM的咪唑濃度可以將目標蛋白洗脫完-全。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為了避免交叉污染，將金屬離子剝離后可進行在位清洗過程。可采用以下溶劑進行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。