普施安紅-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

Red NUPharoseFF是活性紅120（又稱普施安紅HE-3B）活性染料鍵合在NUPharose瓊脂糖微球上得到的親和填料。活性紅120是多環(huán)染料，與NADP+具有結(jié)構(gòu)類似性，可用于純化核苷酸依賴性酶、脂蛋白、乳酸脫氫酶、纖溶酶原、肽、激素等的純化。除了作為親和填料使用，本產(chǎn)品配基含芳香環(huán)和陰離子，也通過靜電作用或者疏水相互作用進(jìn)行非親和純化。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，；c 10 cm 柱高下的最 大測試流速。

3 、使用方法參考

 3.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。Red NUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的裝柱液，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

3.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A對應(yīng)為準(zhǔn)。可以選擇磷 酸鹽、Tris-HCl等常見的緩沖體系。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如Red NUPharoseFF產(chǎn)品對的動態(tài)結(jié)合載量為~15mg/mL，純化時的上樣量可為7.5~12mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。上樣前需要對樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）、過濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A 再平衡層析柱。

3.5 洗脫（Elution）

通常在緩沖液A中添加3 M NaCl或者2 M KCl可將目標(biāo)蛋白洗脫。

3.6  再生（Regeneration）

純化后可用弱酸和弱堿性緩沖液交替沖洗色譜柱3~4 次，進(jìn)行填料再生，例如0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl（pH4.5）和0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl（pH8.5）。然后用平衡緩沖溶液平衡。

3.7 在位清洗（CIP）

通常上述的洗脫和再生過程可將填料徹-底清洗。若發(fā)生柱壓升高，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴荆刹捎靡韵氯軇┻M(jìn)行在位清洗：0.1~0.5 mol/L NaOH、70%乙醇或30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

3.8  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇并添加0.5M NaCl保存。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。