藍(lán)膠-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

Blue NUPharoseFF 是一種染料親和填料，通常稱(chēng)為藍(lán)膠，Blue NUPharose FF的配基為三嗪類(lèi)活性染料，特殊的結(jié)構(gòu)決定了其與蛋白結(jié)合的復(fù)雜性，一般認(rèn)為其通過(guò)靜電相互作用、疏水相互作用以及氫鍵等作用力與蛋白結(jié)合，適用于脫氫酶、激酶、血漿類(lèi)蛋白等的分離純化。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，4 min 停留時(shí)間；c 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速。

3 、染料親和層析原理

 Blue NUPharose FF 配基的特殊結(jié)構(gòu)決定了其對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。除對(duì)蛋白質(zhì)分子上的二核苷酸鏈具有親和作用外，其蒽醌雜環(huán)與蛋白質(zhì)分子非極性面之間存在疏水作用，芳香環(huán)上的磺酸基又使其具有離子交換基團(tuán)的性質(zhì)，可能導(dǎo)致蛋白與配基之間存在非均一結(jié)合。

因此對(duì)于不同的蛋白及配基和蛋白之間的結(jié)合情況也不盡相同。以BSA為例，pH值的變化對(duì)其在Blue NUPharose FF上的吸附影響非常顯著。隨著pH值的升高，吸附容量急劇下降。主要原因是隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)分子上帶有正電荷的區(qū)域?qū)p小，導(dǎo)致與染料之間的靜電相互作用減弱，所以吸附量降低。當(dāng)pH值在5.5~8.0降低時(shí)，蛋白質(zhì)吸附容量的提高主要是由蛋白質(zhì)分子中組-氨酸殘基引起的。而BSA分子中具有較高水平的組-氨酸殘基含量(17個(gè)組-氨酸殘基/581殘基)，所以吸附量隨PH值的變化比較顯著。

4 、使用方法參考

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱(chēng)壓縮因子）。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積。Blue NUPharoseFF的壓縮比為 1.15。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的裝柱液，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿(mǎn)，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱(chēng)因子（As）來(lái)評(píng)價(jià).

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

結(jié)合緩沖液常見(jiàn)的磷酸鹽、醋酸鹽等均可作為結(jié)合緩沖液，需根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇合適的結(jié)合緩沖液（記為緩沖液A）。根據(jù)第3章節(jié)的染料親和層析原理，適當(dāng)?shù)偷?/span>pH的結(jié)合緩沖液能促進(jìn)蛋白的結(jié)合，一般情況下pH范圍在5.5~8.0之間宜。

實(shí)際使用過(guò)程中，上樣料液的體積往往較大，在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH 等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg 目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如 Blue NUPharose FF產(chǎn)品對(duì)BSA的DBC10%為~20mg/mL，純化時(shí)上樣量可為10~16mg/mL。 除了DBC10%，也可以測(cè)試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）、過(guò)濾（0.22或0.45 μm）處理，以免堵塞色譜柱，樣品的pH需與上樣緩沖液保持一致。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液 A 再平衡層析柱。

4.4  洗脫（Regeneration）

染料親和的樣品多種多樣，親和原理較為復(fù)雜，相應(yīng)的洗脫方式也需隨樣品不同而改變。通常可以改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度（例如添加2 M NaCl）和極性（例如添加50%乙二醇）。純化酶時(shí)可加入低濃度的輔因子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫。

4.5  再生（Regeneration）

可以采用高pH（0.1MTris，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低pH（0.1MNaAc，0.5M NaCl，pH 4.5）交替清洗4~5次去除結(jié)合較強(qiáng)的蛋白質(zhì)使層析柱再生。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過(guò)程可將填料徹-底清洗。若發(fā)生柱壓升高，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴荆瑢⒔饘匐x子剝離后可進(jìn)行在位清洗過(guò)程。可采用以下溶劑進(jìn)行在位清洗：2mol/L NaCl，1mol/L NaOH、70%乙醇或30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，0.1mol/L KH2PO4，pH 8.0。使用過(guò)后可繼續(xù)相同的溶液保存。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存。