肝素-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

Heparin NUPharose FF和Heparin NUPharose HP是肝素親和填料，FF為Fast Flow的縮寫，具備快流速的特點，可用于快速純化蛋白質(zhì)，適用性廣，易于放大。HP為High Performance的縮寫，具備分辨率高的特點。肝素親和的原理較為復(fù)雜，一般認(rèn)為肝素與蛋白的結(jié)合 是離子相互作用、氫鍵與范德華力等多種驅(qū)動力共同作用的結(jié)果。肝素填料主要用于凝-血酶III、凝血-因子、脂蛋白、酯酶、激素、干擾素等的分離純化。也有文獻報道將肝素填料用于外泌體的純化。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，重組 人酸性成纖維細胞生長因子（rh-aFGF），6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流 速。

3 、使用方法參考

3.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。Heparin NUPharoseFF的壓縮比為~1.15，Heparin NUPharose HP的壓縮比為~1.20。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

3.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

3.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，可用初始緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導(dǎo)、pH等參數(shù)不變。本產(chǎn)品的緩沖液體系可為磷酸鹽、檸檬酸鹽和Tris-HCl等，濃度為10~20 mM ，pH為7~8為宜。

樣品通常溶于上述緩沖液A，或者將樣品溶液進行換液處理，置換成緩沖液A體系。上樣量可按“mg 目標(biāo)蛋白/mL填料"來設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如Heparin NUPharoseFF產(chǎn)品對rh-aFGF的DBC10%為~10mg/mL，純化時的上樣量可為5~8mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。

3.4  洗雜（wash）

在緩沖液A中添加一定量的鹽對上樣后的色譜柱進行沖洗可以抑制非特異性吸附，從而提高產(chǎn)物純度。200~600mM的NaCl是常用的提高離子強度的鹽，具體的離子強度可以通過線性梯度或者階躍梯度確定。洗雜的體積通常為3~10個柱體積。

3.5  洗脫（Elution）

洗脫過程則可以進一步提高緩沖液A中的鹽濃度，添加1.5~2 M的NaCl可將目的蛋白有效洗脫。

3.6  再生與在位清洗（CIP）

通常可用5 CV的洗脫液將填料再生。若有失活蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)在再生時洗不掉,可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下選擇進行在位清洗：0.1mol/L NaOH、非離子型表面活性劑等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。具體的CIP溶液選擇可參考下表。

3.7  填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，含50mM醋酸鈉，使用過后可繼續(xù)用相同的保存液。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。