次氮基三乙酸-交聯瓊脂糖

1 、產品介紹

IMAC NUPharose HP是含次氮基三乙酸（NTA）基團的金屬螯合填料，主要用于帶組氨-酸標簽（His-tag）蛋白的親和層析。HP為High Performance的縮寫，意為高分辨，微球的平均粒徑為~35μm。IMAC NUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子后使用，也提供螯合后可直接使用的填料及相應的預裝柱，螯合Ni2+的產品為Ni-NTANUPharose HP。

通過配基修飾過程的優化，產品做到了親和力和特異性的平衡：對帶組氨-酸標簽蛋白的結合量大于50 mg/mL的同時，一步純化后樣品純度可達90%以上。除了組-氨-酸，金屬螯合填料也可與色-氨酸、半胱-氨酸殘基形成配位結合，因而這款填料也可用于純化不帶標簽但含這些氨基酸殘基的蛋白，例如人脫鐵轉鐵蛋白。

與亞氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，具有如下特點。

l 對螯合劑、還原劑、堿等試劑的耐受性更好。例如樣品中含有1mM EDTA、1~10 mM β-巰基乙醇或5 mM DTT時，可用Ni-NTANUPharose FF正常純化，純化后可用0.1~1 M NaOH清洗。

l 純化過程洗脫液中脫落的金屬離子可低至ppb（10-12）級，脫落的金屬離子相對于目標蛋白的摩爾比可低于 0.1。

2 、產品特點與技術指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達帶組-氨酸標簽的重組蛋白，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速；d 剝離金屬離子后 CIP 過程的 pH 穩定性

表中為幾款金屬螯合填料對各種溶液環境的耐受性測試（靜態結合載量測試結果），其中

√表示基本不影響或降低 5%以內

!表示略有影響，降低 15%以內，可使用

!!表示有影響，降低 30%以內，使用需注意

×表示影響大，降低 30~50%，不建議使用

××表示影響很大，降低 50%以上，無法使用

注：a 樣品中直接加入試劑，其中 20 mM TCEP 的影響原因是直接加 TCEP 對 pH 有較大影響， EDTA-2Na 的影響原因是剝離 Ni2+ ；b 填料用試劑處理至少 2 h，清洗后填料的性能。

 3 、金屬螯合親和層析

金屬離子親和層析是基于蛋白質分子表面的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Cu2+、Ni2+、Zn2 、Co2+和Ca2+形成穩定的配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為螯合離子來純化6個組氨-酸組成的標簽蛋白最為常見，本說明書也以該體系為例簡要闡述次氮基三乙酸（NTA）基團的親和原理（圖1）。

NUPharose基球修飾上NTA配基后，該配體擁有四個配位基團，其中一個氮原子和三個氧原子可以與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數的八面體結構，剩余的兩個自由配位點可以與溶劑分子或蛋白質分子結合。Ni2+與組氨-酸標簽蛋白的兩個組氨-酸殘基的咪唑基團配位結合的過程即為金屬螯合填料與目標蛋白的特異性結合過程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭與Ni2+的結合。降低pH會影響金屬離子與配體的結合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低 4，pH過低會將剝離金屬離子。

金屬離子親和層析過程的非特異性吸附可能會來自離子相互作用、金屬離子與含組氨-酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩沖液的離子強度得到抑制，通常添加500 mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過程中添加咪唑而除去。經過優化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。

IMAC NUPharose HP填料在使用過程中金屬離子掉落量少，可連續使用多次。當填料性能明顯下降后可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳后再生使用。

4 、使用方法參考 

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體積。IMAC NUPharose HP和Ni-NTANUPharose HP的壓縮比為~1.20。為使達到壓縮比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分數為67%），使用前攪勻。